出乎意料！HPV阳性的口咽癌患者预后更好？临床医生与方法学专家共同深度解析，2021年3月，Cancer 发表了一项关于HPV感染与口咽癌预后的研究结果，作者是来自英国布里斯托大学医院和韦斯顿国家保健服务信托基金会的研究人员。
基于1411例口咽癌患者的临床随访观察，研究人员发现，HPV（16型）阳性患者的生存情况反而好于HPV阴性患者！换句话说，HPV感染反而成了口咽癌患者生存的保护因素……
为了更好地为大家解读HPV感染和口咽癌之间的关系，《协和医学杂志》特别邀请了中国医学科学院北京协和医院耳鼻喉科朱莹莹医生和中国医学科学院基础医学研究所流行病与卫生统计学系的何慧婧老师，带大家一起看看HPV的“另一面”，并以该研究为例，带大家更好地感受临床科研方法学的魅力。
口咽癌是常见的致死性疾病，在世界范围内，每年约有93000人发病，并有51000人死亡。口咽癌的发病率在多个国家（多数为发达国家）呈上升趋势。在英国，大约每年有3000人被诊断为口咽癌。
世界卫生组织公布的最新数据显示，2020年世界范围内口咽癌发病率最高的地区是中-东欧，死亡率最高的地区是西欧；包括中国在内的东亚地区发病率和死亡率均处于较低水平。
WHO数据显示，2020年中国有5604人被诊断为口咽癌，占所有肿瘤的0.12%；因口咽癌死亡的人数为2905人，占所有肿瘤死亡人数的0.1%。
饮酒和吸烟是口咽癌公认的危险因素，然而，最近科学家发现HPV感染也是口咽癌的重要发病诱因，并且显著影响患者的生存情况。
HPV（Human papillomavirus）中文全称为“人乳头瘤病毒”，1949年被首次发现，属于乳多空病毒科，为无包膜病毒，直径约55nm。HPV为双链环状DNA病毒，基因组长度约7900bp，所有蛋白转录相关开放阅读区局限在其中一条链。
基因组根据功能可分为三部分：a）早期序列（E1、E2、E4、E5、E6、E7，部分有E3、E8），这些与病毒复制及致癌作用相关；b）晚期序列（L1、L2），主要翻译L1及L2病毒衣壳蛋白；c）上游非编码序列即长调控序列（LCR）。
所有HPV携带者均可作为传染源传播病毒，最主要的传播途径是性接触传播。其他传播方式，如与他人共用浴盆、毛巾、马桶坐便器等理论上也可造成间接传播。此外，妊娠分娩过程中，婴儿也可能在经过母亲产道时被传染。
HPV可通过口腔-生殖器官的直接接触（口交）在口腔和生殖器官之间传播。HPV感染在肛门、生殖器周围非常普遍，近半个世纪以来，随着人们性观念的改变，口交已成为一种常见的性交方式，并且在口交时往往不会使用安全措施进行防护，增加了HPV的传播几率。研究显示，性生活比较活跃、性伴侣较多的人感染HPV的几率较高（女性84.6%，男性91.3%）。
首先，可以保护自己不受HPV感染而引发相关疾病，包括口咽癌、口腔癌、肛门癌、阴茎癌等恶性肿瘤以及生殖器疣。其次，因为HPV主要通过性行为传播，感染了HPV的男性，还可能通过性生活将HPV传染给性伴侣，增加性伴侣的健康风险。
男性接种HPV疫苗可以降低自身携带病毒的几率，预防双方HPV交叉感染，也间接减少了女性罹患宫颈癌的风险。
截至2003年，已经发现的HPV超过200种，其中可感染人的HPV约30多种。根据HPV与宫颈癌的关系，又可以分为低危型和高危型。目前我们的疫苗主要包括二价疫苗（预防高危16/18型HPV），四价疫苗（预防高危16/18型和低危6/11型HPV）以及九价疫苗（预防高危16/18/31/33/45/52/58型和低危6/11型HPV）。可见疫苗并没有覆盖所有病毒类型。
补充一点，虽然HPV疫苗并没有覆盖所有的HPV型别，但对于易感人群来说，疫苗可以预防几种高危亚型，仍然可以起到很好的疾病预防效果，“防患于未然”。
介绍完HPV的相关知识点，从临床医生的角度我们也很想知道，如果想研究HPV感染和口咽癌预后之间的关系，应该怎样设计和分析呢？
关于HPV和口咽癌预后相关的研究不少，今年就有一篇论文发表在Cancer 杂志上。今天我们就以此篇论文为例，一起看看在探究HPV与头颈肿瘤预后关系以及类似的临床研究中，我们在研究设计、资料收集和统计分析环节都有哪些需要注意的问题。
首先，关于研究对象的筛选。在这篇论文中，为了研究HPV感染与口咽癌预后的关系，研究人员从名为“头颈5000”的一项前瞻性队列研究中选取了1411例口咽癌患者作为研究对象，病理类型全部为鳞状细胞癌。
“头颈5000”这是由英国布里斯托大学（University of Bristol）在2011年开展的一项关于头颈部肿瘤患者的大型队列研究，研究覆盖了全英国76家中心的5511名头颈肿瘤患者。项目的主旨在于发现和描述影响头颈肿瘤患者生存和心理健康的因素。所有16岁以上的头颈肿瘤患者均可被招募，基线研究对象的应答率为49%。患者的临床和诊断信息等由各中心的研究人员收集，健康和生活方式信息则由患者自填问卷完成。随访正在进行中。
对于一些较大的癌肿来说，由于其可跨越几个解剖学部位，不太容易明确其起源位置而难以将其确切归类。研究对象的入组过程可以用以下流程图清楚地展示。
研究对象筛选之后应该就是资料的收集过程了。在这项研究中，HPV是我们感兴趣的暴露因素，对于HPV感染信息的收集，应该是非常关键的过程。
文章也对HPV筛查作了详细的描述。该研究中所有受试者在基线时都要抽血做HPV感染筛查，所筛查的HPV型别包括HPV16、18、31、33、 35、45、52、58。HPV抗体主要检测了L1、E6和E7，HPV16、18型别还另外检测了E1和E2。根据筛查结果，患者被分为两类：HPV阳性（HPV-driven）和HPV阴性（HPV-negative）。
除HPV感染信息外，在资料收集过程中，我们还应注意收集其他影响结局指标（在这项研究中为是否存活）的重要信息，例如肿瘤分期、治疗方案、是否存在合并症等。研究者收集了患者的肿瘤-淋巴结-转移（TNM）信息，并依据第7版的TNM分期指南进行了分类。对于HPV阳性的患者，还应用了国际口咽癌分期协作网络（International Collaboration on Oropharyngeal Cancer Network for Staging）提出的替代分期方法。对于治疗方案信息的收集，研究者按照受试者实际接受治疗的情况，把他们分为7组：
除基本的临床信息外，还需要了解患者的人口社会学信息，以及健康生活方式信息等。这些健康相关信息在了解疾病致病及预后影响因素中也十分重要。因此，研究者通过问卷和历史资料回顾等方式收集了患者年龄、性别、吸烟史等信息。
以上说的均是暴露因素或者重要的可能存在混杂的因素的收集，对于临床研究来说，明确结局指标并准确地采集结局信息是十分重要的。
在这个研究中，结局指标比较单一，就是生存状态（存活vs.死亡）。研究者通过关联受试者在英国国家医疗服务体系（National Health Service，NHS）数据库中的信息，来进行受试者在随访期内死亡及死因数据的收集。随访截止日期为2020年2月1日。
是的，这个研究中只有一个结局指标。有些预后研究可能有不只一个结局观察指标，这时一般会区分主要结局指标和次要结局指标。例如，不仅可以观察受试者是否生存，还可以对生存质量、卫生经济学相关的指标进行评价，这时可以设计一些次要结局指标。这些指标的设立当然要结合想要回答的科学问题，以及目前研究中资料的可获得性。如果是基于历史资料的回顾性研究，可能某些研究结局指标是无法获取的。
统计学分析的基本思路是由浅入深，层层递进的。以这个研究为例，预后分析一般都涉及到生存资料，核心是生存分析，这里也涉及到不同的统计学方法。
首先是基本描述。研究者应用Pearson卡方检验（适用于分类资料）对两组受试者的基本特征进行了比较，看看两组人群在基线时是否存在差别。两组人群之间在某些指标上存在差异，可以为后续的统计建模校正混杂因素等环节提供一些线索。
其次，是本研究中核心的生存分析部分。研究者应用了Cox比例风险回归模型用来评估HPV感染与口咽癌死亡之间的关系。通过Cox回归计算风险比（Hazard ratio, HR）值及其95%可信区间。
Tips: HR是生存资料分析中常用的评估风险因素健康效应的指标，代表一组研究对象发生结局事件的瞬时风险与另一组研究对象发生结局事件的瞬时风险比。在本研究中，可以理解为HPV阳性患者死亡的瞬时风险与HPV阴性者死亡瞬时风险的比值。HR>1，说明与HPV阴性相比，HPV阳性是死亡的风险因素，即增加瞬时死亡风险；HR<1，则说明HPV阳性是死亡的保护因素，即降低了瞬时死亡风险。风险比可以从Cox回归模型中获得，是研究者常用的评价疾病预后影响因素的指标。需要注意的是，一般的Cox回归模型需要满足等比例风险的前提假设，即不同组人群在任意时刻的瞬时死亡风险比值是恒定的。如果不同组的风险比值存在随时间变化的情况，则需要应用其他类型的回归模型
在Cox回归中研究者采用了两个模型，一个是部分校正模型（partially adjusted model）,另一个是完全校正模型（fully adjusted model）。部分校正模型里校正的因素包括年龄、性别，而完全校正模型里的校正因素包括年龄、性别、吸烟（目前吸烟或不吸烟）、合并症（无，轻度，中度，重度）。
校正主要是为了控制或消除混杂因素（confounding factor）或其他因素对暴露-结局真实效应的影响，不校正的话很可能得到虚假（效应值的夸大、削弱甚至方向相反）的关联结果。其中消除混杂因素的影响是应用模型校正的重要原因和主要目的。混杂是指由于某个第三变量的作用，致使研究因素与结果的联系被歪曲，这个第三变量就叫混杂变量或者混杂因素。混杂因素的判断标准通常可以这样理解：与暴露因素和结局指标/事件均相关，但又不是存在于二者之间的中间环节。用单向无环图可以清晰地表示（图5）：
在这项研究中，吸烟既与HPV感染有关（吸烟状况在HPV阳性和阴性组中的分布不同），又与口咽癌患者的预后相关（根据既往报道，吸烟者的生存情况较不吸烟者差），且不是HPV感染和口咽癌预后的中间环节（即HPV感染和口咽癌预后的关系不需要通过吸烟起作用）。
因此，吸烟在这项研究中是一个混杂因素。研究者将吸烟这一变量纳入多因素模型以消除其可能的混杂作用。除了模型校正之外，常用的控制或消除混杂的方法还有分层分析。例如，研究者对HPV感染与口咽癌预后的关系在不同年龄组、性别、吸烟状态、肿瘤位置的患者中分别进行了探索。需要注意的是，分层分析往往意味着样本量的损失（例如每个年龄组的人数可能较少，不满足构建模型的最小样本量需求），对于一些小样本的研究，分层分析可能并不适合。
首先是基本特征的描述。1411例患者中，超过70%HPV阳性（1001例，70.9%）。HPV阳性患者主要为年轻男性。吸烟状况在两组之间存在较大差异，HPV阳性组仅8%的患者目前吸烟，而HPV阴性组则有接近50%的患者吸烟。与HPV阴性患者相比，HPV阳性患者的肿瘤分期更晚（3期或4期）。HPV阳性患者更多地接受了放化疗，且合并症的发生率也更低。HPV阴性患者肿瘤较少发生在扁桃体部位，大部分在其他位置。
第二部分，也是结果中最核心的部分，是展示HPV与口咽癌预后的关系。受试者的中位随访时间为5.9年（最短13d，最长8.9年），437例患者在随访期内死亡。总体来看，HPV阳性的口咽癌患者生存情况更好（表2），HPV阳性患者的死亡风险是HPV阴性患者的43%（95%可信区间：33%-56%）
正如前面提到的，研究人员在不同特征的患者中还进行了分层分析，探讨HPV感染状况和其他因素的相互影响。例如，在表2所展示的结果中还有不同年龄组、性别、吸烟状况与疾病预后的关系。HPV阳性患者的预后情况整体优于HPV阴性患者，而这种健康效应在65岁以下人群中似乎更明显；女性HPV阳性患者的生存获益略高于男性HPV阳性患者（HPV感染的保护效果更强）。刚才提到吸烟可能是个混杂因素，在表2里通过对吸烟状况进行分层分析，避免了由于吸烟状况在HPV感染不同组别中分布不同而造成的HPV感染和口咽癌预后关联效应值的有偏估计。从结果中可以发现，无论是否吸烟，HPV阳性组的死亡风险均低于HPV阴性组。
此外，除了将HPV感染状态一分为二，进行“有或无”的分类外，还可以考虑HPV抗体的浓度值，探讨HPV抗体浓度和预后的剂量-反应关系。如在表3中，研究者就以E16抗体浓度值作为自变量，把HPV阴性作为参照组，探索E16抗体不同浓度和患者预后的关系。虽然结果显示抗体浓度值和预后情况不存在剂量-反应关系，但这种分析思路值得小伙伴们借鉴。
在这项研究中，HPV16型感染被定义为HPV阳性，然而，有些患者的HPV16抗体阳性状态可能是由于和其他HPV型别的交叉反应引起的。于是，研究者把合并其他型别HPV感染的受试者挑选出来，将他们从分析数据集删除之后重复了上述分析（敏感性分析）。除了以上结果外，文章中还用生存曲线描绘了不同组别患者的生存情况，感兴趣的读者可以阅读原文。
文章解读完了，读者可能还有不少疑问，例如，我最大的困惑就是，为什么感染HPV的口咽癌患者反而预后更好呢？
关于HPV相关口咽癌预后较好的原因，目前尚无统一意见。部分学者将HPV阳性肿瘤预后较好归因于对放化疗的敏感性增强。E6介导的p53降解作用可能与HPV阴性头颈肿瘤中p53基因突变不同，未突变的残存的p53可以增加对DNA损伤因子的敏感性，使得HPV阳性头颈肿瘤中存在完整的放化疗凋亡反应。
其他的研究结果表明，在HPV16阳性口咽癌中存在RBBP4过表达及RBBP4依赖的Akt去磷酸化，可能抑制放疗抵抗通路。同时，以顺铂为基础的化疗可能抑制HPV E6癌蛋白的功能从而恢复p53活性。然而，单纯手术的HPV阳性肿瘤患者较分期相当的HPV阴性患者的预后仍有所改善。
最新的临床试验发现，HPV阳性和HPV阴性的头颈部鳞癌患者对免疫治疗的反应存在差异，提示HPV阳性头颈部鳞癌可能存在独特的肿瘤免疫微环境。HPV相关头颈肿瘤基因突变较HPV阴性头颈肿瘤明显减少，主要与病毒相关癌蛋白E6和E7等的作用相关，可能可作为外来抗原刺激机体产生较强的免疫反应，引起感染细胞的清除。
虽然感染HPV和罹患口咽癌都是不幸的事，但正如人们常说的，“上天是公平的，当为你关上一扇门的同时，总是会为你打开一扇窗”，HPV阳性者的预后反而更好。当然，无论是否感染HPV，积极配合医生治疗，保持乐观向上的心态，都将有助于健康和提升生活质量。在此也祝愿大家身体健康，生活幸福！本期提到了临床研究中常见的疾病预后研究，实际上预后研究中的方法学内容还是十分丰富和比较复杂的。今后有机会期待和大家进行更多交流。
6. 蔡淼纯，吴娴波，毛琛. 风险比与中位生存时间的关系. 中华预防医学杂志. 2019; 53(5): 540-544.